Όσον αφορά το εσωτερικό του ναού, οι επιφάνειες των τοίχων καλύπτονταν με πολύχρωμη ορθομαρμάρωση (όπως παραμένουν και σήμερα) και διακοσμούνταν με πολυάριθμους ψηφιδωτούς σταυρούς και διακοσμητικά σχέδια σε χρυσό βάθος. Στο νοτιοδυτικό σπειροειδές κεκλιμένο επίπεδο, κλειστό για το κοινό, μια σωζόμενη τοιχογραφία με σταυρό μπορεί επίσης να ανήκει στην Ιουστινιάνεια περίοδο. Μια τέτοια απλή διακόσμηση είναι κατανοητή, εάν ληφθεί υπόψη το πολύ σύντομο χρονικό διάστημα στο οποίο ανεγέρθηκε ο καθεδρικός ναός (μόνο πέντε χρόνια!). Οι κίονες επίσης αποτελούνται από διάφορες ποικιλίες χρωματιστού μαρμάρου και είναι το χαρακτηριστικό γνώρισμα ολόκληρης της εσωτερικής όψης του ναού: στο ισόγειο υπάρχουν κίονες από πράσινο θεσσαλικό μάρμαρο, καθώς και κίονες από πορφυρίτη σε δεύτερη χρήση, ενώ πράσινοι κίονες κυριαρχούν στα υπερώα. Οι κίονες φέρουν κιονόκρανα από λευκό μάρμαρο. Τα μάρμαρα της Αγίας Σοφίας αποτέλεσαν αντικείμενο μεγάλου θαυμασμού από τους Βυζαντινούς και ο Προκόπιος προσθέτει: «τίς δὲ τῶν τε κιόνων καὶ λίθων διαριθμήσαιτο τὴν εὐπρέπειαν, οἷς τὸ ἱερὸν κεκαλλώπισται; λειμῶνί τις ἂν ἐντετυχηκέναι δόξειεν ὡραίῳ τὸ ἄνθος...». Για το γλυπτό διάκοσμο της Αγίας Σοφίας δούλεψαν γλύπτες από τον Άγιο Πολύευκτο, ένα ναό με πολύ εντυπωσιακό γλυπτό διάκοσμο, που αποτελούσε πρόκληση της δωρήτριας Ανικίας Ιουλιανής προς τον Ιουστινιανό· ωστόσο, ή ίσως ακριβώς ως απάντηση στην πρόκληση ακολούθησαν στην Αγία Σοφία μια πιο αντικλασική τεχνοτροπία με λιγότερα ανατολικά μοτίβα σε σχέση με τον Άγιο Πολύευκτο, ενώ εισήγαγαν τα αψιδωτά επιστύλια και τα κιονόκρανα που αποτέλεσαν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της πρώιμης βυζαντινής αρχιτεκτονικής στην πρωτεύουσα. Καθώς το εσωτερικό φωτιζόταν καλύτερα κατά τον 6ο αιώνα απ’ ό,τι σήμερα (μεγαλύτερα παράθυρα, πολυκάνδηλα και κεριά), η οπτική εντύπωση που θα προκαλούσε η πολύχρωμη διακόσμηση του εσωτερικού του ναού πρέπει να ήταν πολύ πιο εντυπωσιακή. Επιπλέον, η παρουσία λειτουργικών σκευών έκανε την εμφάνιση του κεντρικού κλίτους και της αψίδας πολύ διαφορετική από αυτό που βλέπει κανείς σήμερα. Στην αψίδα τοποθετήθηκε ένα σύνθρονο αποτελούμενο από επτά ημικυκλικούς αναβαθμούς, στον ανώτερο από τους οποίους τοποθετήθηκε ο πατριαρχικός θώκος πάνω στον κεντρικό άξονα. Μπροστά από το σύνθρονο βρισκόταν ένα κιβώριο, αποτελούμενο από τέσσερις ασημένιους κίονες που έφεραν έναν οκταγωνικό ουρανό. Η Αγία Τράπεζα της Μεγάλης Εκκλησίας, φτιαγμένη από χρυσό και διακοσμημένη με ημιπολύτιμους λίθους, βρισκόταν κάτω από το κιβώριο. Ένα ύφασμα κεντημένο με μετάξι και χρυσό και διακοσμημένο με τις εικόνες του Χριστού και των Αποστόλων Πέτρου και Παύλου κάλυπτε την Αγία Τράπεζα. Το Βήμα καταλάμβανε μεγάλο μέρος του χώρου κάτω από το ανατολικό ημιθόλιο και αποτελούνταν από μαρμάρινα θωράκια και ασημένιους κίονες που έφεραν ένα επιστύλιο. Ο άμβωνας από μάρμαρο και ελεφαντοστό είχε δύο κλίμακες. Ένας καλυμμένος με παραπετάσματα χώρος, απ’ όπου ο αυτοκράτορας παρακολουθούσε τη Θεία Λειτουργία, βρισκόταν πιθανώς στο ανατολικό άκρο του νότιου κλίτους. Η θέση της αυτοκράτειρας, από την άλλη, ήταν στο υπερώο, πάνω από τον εσωνάρθηκα.
